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世界肝炎日丨自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化

7月28日,是已故诺贝尔奖得主巴鲁克·布隆伯格的诞辰日,为纪念这位乙肝病毒发现者,世界卫生组织决定,将每年的7月28日定为世界肝炎日。

今天,是世界卫生组织(WHO)确定的第十二个“世界肝炎日”。今年的宣传主题是“ 防治肝炎,健康你我”。


自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化

郭晓钟 王迪 邵晓冬 赵佳军 李宏宇 崔忠敏 刘峰

沈阳军区总医院消化科


世界肝炎日丨自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化-1.jpg


中航生物自主研制的“有核细胞处理试剂盒”是国内最早拥有自主知识产权的干细胞分离提取原研产品。拥有国家CFDA注册的二类医疗器械注册证,专门用于从人骨髓血、外周血、脐带血中分离、纯化出成体干细胞。目前已应运于临床超过40000例,为传统治疗无法治愈的疾病提供了一个全新的治疗手段——细胞治疗。 为患者解除病痛、提高生存质量、延长寿命提供了一个机会,获得广大患者、医学专家的欢迎和一致好评!


摘要


目的

分析自体骨髓干细胞移植对肝硬化患者的治疗作用。


方法

选择失代偿期肝硬化患者78例,其中肝炎肝硬化56例、酒精性肝病21例、血吸虫性肝硬化1例,年龄26〜67岁。 

从患者器后上棘抽取骨髓,体外分离纯化骨髓源性干细胞,通过肝动脉置管移植入肝脏,在移植后 2.4.8周复査肝脏功能,观察实验室指标改善、Child-TurcottaPugh分数变化及不良反应情况。


结果

移植后第4周,患者血浆白蛋白由(32.91 + 5.58) g/L升至(38.32 + 6.45) g/L,丙氨酸转氨酶 由术前(96.92±83. 91) U/L降至(73. 48土 18. 46) U/L (P<0. 01)。凝血酶原时间从移植前的 (16.66±3.91) s逐渐下降至移植后的(15. 52 + 3. 35) s,纤维蛋白原从(2. 22士0.88) g/L逐渐升高 至(2.58+0. 88) g/L。

干细胞移植术后患者临床症状明显改善,其中食欲改善、体力好转72例 (92.3%),腹水减少或消失及下肢浮肿减轻70例(89. 7%),腹胀减轻68例(87.2%)。近期未发生与干细胞移植相关的并发症。


结论

骨髓干细胞移植是治疗失代偿期肝硬化患者安全、有效的方法。


【关键词】骨髓干细胞移植;移植,自体;肝硬化

失代偿期肝硬化是各种肝纤维化疾病的终末期,其特征性的表现为肝结构紊乱及假肝小叶形成。原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)是终末期肝硬化患者最有效的治疗方法,但OLT仍有较大局限性,受到器官供体缺乏、治疗费用高昂和并发症多等原因的限制。据资料显示,在每年需要行肝移植的肝硬化患者中,能获得 移植手术治疗的患者不到10%,而绝大多数患者 死于肝硬化终末期的病理进程。因此,临床上寻 找一种有效的替代治疗手段十分必要丄电。

近几年来,细胞生物学技术的发展使骨髓干细胞(bone marrow stem cell, BMSC)及祖细胞的分离和鉴定有了很大的进步,这给我们治疗遗传性和慢性肝病带来新的思路。在人骨髓中至少存在两种干细胞,包括间充质干细胞和造血干细胞。研究证明,通过注入BMSC,可以逆转肝纤维化过程,而且干细胞可以在体内转化成功能性肝细胞技句。

我们釆用患者自体骨髓源性干细胞作为供体,并在体外进行分离纯化,再经肝动脉途径移植入患者肝内,使干细胞在肝脏中分化生长为具有功能的肝细胞,使肝硬化患者的肝功能得到效果 明显的恢复和重建。


对象和方法

1.病例选择:收集2007年5月一2008年12 月在沈阳军区总医院消化科住院的78例失代偿 期肝硬化患者,年龄26〜67岁,其中女性29例, 男性49例,中位年龄51岁。78例患者中肝炎肝 硬化56例,酒精性肝硬化21例,血吸虫性肝硬化 1 例;肝功能 Child-TurcottLPugh(CTP)分级 B 级29例,C级49例。所有78例患者术前均存在 肝硬化常见症状和体征,包括纳差、乏力、腹胀,同 时经腹部B超或腹部CT检査均明确肝硬化诊 断,排除肝脏恶性肿瘤。术前实验室检査包括血 清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、 总胆红素(TBIL)、血浆白蛋白(ALB)、凝血酶原 时间(PT)和纤维蛋白原(FIB),部分患者还进行 了血氨、甲胎蛋白及血脂检测。患者入院后根据 病情予对症治疗,如部分重度腹水、下肢浮肿者, 给予利尿及腹水回输,症状改善后,内科停止治 疗,进行干细胞移植术前准备。治疗前患者签署 知情同意书。


2.术前准备:术前给予粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)动员BMSC,每天1次皮下注射 4 fzg/kg,连续2 d;术前1 d行碘过敏试验、双侧腹 股沟备皮,术前4 h禁食、水,移植当天对患者进行 隔离,骨髓穿刺术前5〜10 h进行房间消毒。

3.BMSC采集及分离:取右侧骼后上棘为穿刺点,局部麻醉消毒,在无菌条件下,以18号骨髓穿刺针穿刺,抽取骨髓180〜200 ml,以7500 U肝素抗凝,然后采用中航生物【细胞处理试剂盒】负筛选法,进行BMSC的体外分离及纯化,获取单个核细胞计数3.6X108/ml~ 1.8X10n/ml,釆用流式细胞仪检测CD34+干细胞数为107ml~109/ml,4 ℃冰箱保存,时间不超 过3h。

4.移植方法:在数字减影血管造影下经股动 脉穿刺插管,置管于肝固有动脉并造影,观察肝内 血管情况及有无占位性病变。将待用的细胞悬液 于3 h内分别经左、右肝动脉缓慢注入,术毕拔管,穿 刺点加压包扎后患者返回病房,术侧下肢制动6h。

5.疗效观察:术后观察指标包括患者临床症 状3项、体征2项,实验室指标6项及CTP分级、 分数变化。术后2,4,8周分别复査ALT、AST、 TBIL,PT、FIB及血浆ALB等指标。根据脩床症 状、体征和实验室检查结果及CTP分数,将疗效 分为显效(临床症状、体征有3项以上好转,实验 室指标有3项以上改善,CTP分数提高3分以 上)、有效(临床症状、体征至少有1项好转,实验 室检査指标至少有2项改善)、无效(临床症状和 体征无改善,实验室检查指标无好转)

6.统计学方法:移植前、后实验室数据以均 数士标准差(x拔±s)表示,同一患者治疗前、后比较 釆用配对t检验,P≤0. 05为差异有统计学意义。


结果

  1. 实验室指标改变:在干细胞移植后第2周 实验室指标开始出现变化,至第4周多项指标出 现显著变化,其中血清ALB较术前明显升高,转 氨酶下降,PT明显下降,FIB明显升高,见表1。提示移植前、后肝功能有显著改善,凝血机制亦有 显著改善。但移植前、后TBIL水平变化差异无统 计学意义(P>0. 05)。 

  2. 临床症状及体征:自体BMSC移植后第4 周开始,大多数患者临床症状和体征有明显改善, 其中腹水减少或消失及下肢浮肿减轻70例 (89.7%),食欲改善、体力好转72例(92.3%),腹 胀减轻68例(87.2%)。

  3. CTP评分变化:移植前CTP B级患者的 评分为8. 86 + 0.35, C级患者为12. 10±1.16,至 移植第2、4、8周时,B级患者CTP评分分别 为7. 93士0.91、7. 24+0. 94和肝硬化是临床常见6.31+0. 75, C 级患者分别为 11.86±1.09、 10. 88±1. 22 和 10. 67 + 1. 32,均逐渐下降。

    自体骨髓干细胞移植前与移植后第4周实验室指标变化

    世界肝炎日丨自体骨髓干细胞移植治疗失代偿期肝硬化-2.png

  4. 不良反应:78例患者移植后除因上消化道 出血死亡3例外,近期无严重不良反应,亦未发现 与干细胞移植相关的并发症。术后低热及轻度恶 心各1例,24 h自行缓解。无明显感染症状、肝区疼痛、出血等并发症。


    讨论

    疾病,补充足够的肝细胞、控制肝纤维化的进展甚至逆转纤维化过程,是目前及未来肝硬化治 疗的热点。BMSC是目前备受关注的一种供体细胞,易釆集并可在体外大量扩增、可自我更新并向多种类型细胞转化、体积小易进入肝实质、可自体移植而无免疫排斥反应、无伦理道德问题等优点。目前,国内、外通过BMSC移植治疗肝硬化的 临床研究日益增多,其对肝硬化的治疗作用主要有两个方面,一是促进肝细胞再生,二是控制肝纤维组织形成。

    BMSC促进肝细胞再生的机制已有大量的相 关研究。动物实验研究显示,肝硬化小鼠在 BMSC移植后,脂类代谢激活,血清载脂蛋白a、载 脂蛋白c3、维生素D结合蛋白等水平升高,肝内微 环境的改变可促进BMSC的转化,其转化与肝损 伤的类型及程度有关,肝纤维化与肝硬化所致的 慢性肝损伤更适于采取BMSC移植的方法达到治 疗目的。另外,损伤肝细胞可产生某种信号作用 于BMSC,使其分泌肝细胞生长因子(HGF)至细 胞外,而HGF可促进BMSC分化,且具有抗细胞 凋亡活性,在纤维化肝脏的再生中起重要作用。研究表明,将BMSC注入经G-CSF预处理的慢性 肝损伤小鼠模型体内,发现种植于受体肝脏的外 源性BMSC很少,但受体自身的肝细胞增殖较明 显,肝损伤恢复较迅速,原因为G-CSF与局部微 环境相互作用,动员自身造血干细胞向受损肝脏 归巢,促进内源性肝细胞的增殖。

    BMSC可以通过多种不同的方式抑制肝组织 纤维化形成。许多研究发'现,种植于肝脏的 BMSC通过旁分泌形式分泌多种细胞因子和生长 因子,如白细胞介素(ID-10,肿瘤坏死因子 (TNF)-a、HGF和神经生长因子等,它们在促进 肝脏再生和修复的同时,抑制肝脏炎性反应、促进 细胞外基质(ECM)降解、改善凋亡诱导的肝损伤、 提高血清白蛋白水平。另外,BMSC可影响肝星 状细胞,或通过诱导凋亡减少其数量,或通过减少 转化生长因子(TGF)-pl的分泌抑制肝星状细胞 的激活,从而减少ECM沉积,改善肝纤维化程度。

    为探索骨髓源性干细胞对肝硬化患者的治疗 作用,我们在临床上开展了自体骨髓源性干细胞 经肝动脉移植治疗失代偿期肝硬化的研究。本研究釆用患者自体BMSC作为供体,在体外分离纯化,经流式细胞仪检验并确定CD34+干细胞及其 数量,然后移植入患者肝内,观察实验室各项指 标、临床症状、体征的恢复情况。我们的研究显 示:①移植后第2周实验室指标出现变化,至移植 后第4周,所有患者血清ALB水平均明显升高, 是生化指标中改善最显著的一项,其次是FIB水 平和PT,ALT,AST于术后第4周亦出现明显下 降。②血清TBIL水平虽有下降,但差异无统计 学意义。考虑可能原因是肝硬化时肝细胞损害和 肝小叶结构破坏,导致结合胆红素不能正常排入 细小胆管而反流入血。BMSC移植后短期内,上 述肝硬化的病理损害未能修复,故血清胆红素无 有效下降。

    本组资料还显示:①血清ALB至第4周呈快 速上升状态,至第8周上升速度减慢,有部分患者 甚至比第4周时低,但仍高于术前水平,分析原因 考虑干细胞移植入肝内定植后,在短期内即可分 化大量新生肝细胞,使血清ALB的合成明显提 高,推测干细胞向肝细胞分化的高峰期在第4周 至第8周,之后分化水平下降,但仍可维持在一定 水平。我们在临床上已经开展了二次BMSC移 植,时间选在首次移植后的第3个月到半年内,发现可使患者肝功能指标进一步改善,因病例数及 相关数据还不完整,尚需进一步观察。②CTP B 级患者的分数在术后下降幅度较大,C级患者术 后下降幅度较小,分析原因考虑BMSC移植后的 疗效与术前病情的轻重程度有关。提示对肝硬化 患者进行自体BMSC移植能有效控制临床症状 进展。

    3例患者的死因均为上消化道大出血,术前胃镜检査显示食管静脉重度曲张,提示BMSC移植 短期内不能改善患者门静脉高压状态,中、长期效果尚需进一步临床观察。


    我国是肝病大国,各种原因导致的肝硬化患 者众多。在目前国内中、晚期肝硬化内、外科治疗现状下,自体BMSC肝内移植是临床治疗手段的重大进步和有益补充。


    除药物及OLT治疗之外,BMSC的自体移植给了患者一个新的选择。虽然,BMSC移植尚不能治愈肝病,但可在很大程度上控制肝硬化的进展速度,提高肝硬化患者的生存质量。


    在本研究中,我们釆用的干细胞类型、选择的移植途径、使用的细胞数量均已在临床应用中得到有效证实,但仍有许多问题需要研究和思考,如骨髓源性干细胞是否须进一步鉴别及纯化,分离纯化后的干细胞如果经过体外培养扩增能否进一步提高疗效,干细胞经肝动脉途径移植与经门静脉途径、经脾途径、经外周静脉途径及肝组织 局部注射途径移植的优势对比,干细胞数量及移植手术次数的临床效果观察,均是我们需要进一步观察和解决的问题。

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